構(gòu)建 DNA 文庫時,用 AluⅠ(AG↓CT) 和 HaeⅢ(GG↓CC) 部分消化基因組 DNA 后,將得到的片段用 M.EcoRⅠ 甲基化酶處理,然后加上合成的 EcoRⅠ 接頭,再用 EcoRⅠ 來切割時只有接頭上的位點可被切割,從而保護(hù)基因組片段。
構(gòu)建 DNA 文庫時,用 AluⅠ(AG↓CT) 和 HaeⅢ(GG↓CC) 部分消化基因組 DNA 后,將得到的片段用 M.EcoRⅠ 甲基化酶處理,然后加上合成的 EcoRⅠ 接頭,再用 EcoRⅠ 來切割時只有接頭上的位點可被切割,從而保護(hù)基因組片段。
E.coli 中至少有 3 種依賴于甲基化的限制系統(tǒng) mcrA、 mcrBC 和 mrr ,它們識別的序列各不相同,但只識別經(jīng)過甲基化的序列,都限制由 CpG 甲基化酶(M SssⅠ)作用的 DNA (限制即消化降解)。 Mrr 限制 m6A ; McrA 限制 HpaⅡ 甲基化修飾的位點; McrBC 切割兩套半位點(G/A)mC ,這兩套位點之間間隔 2kb ,最適為 55~103bp ,需 GTP ;大多數(shù)常用的 E.coli 都含這三個限制系統(tǒng)中的一個或幾個,三個都不限制 Dcm 修飾的位點,Mrr不限制 dam、 EcoKⅠ、 EcoRⅠ 修飾的位點。
國內(nèi)甲基化酶行業(yè)前景如何?據(jù)中研研究院出版的《2023-2028年甲基化酶行業(yè)市場深度分析及發(fā)展策略研究報告》顯示
甲基化酶市場需求如何 未來甲基化酶行業(yè)市場還有前景嗎
甲基化酶,原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員,用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。在E.coli中,大多數(shù)都有三個位點特異性的DNA甲基化酶。甲基化酶行業(yè)研究報告主要分析了甲基化酶行業(yè)的市場規(guī)模、甲基化酶市場供需求狀況、甲基化酶市場競爭狀況和甲基化酶主要企業(yè)經(jīng)營情況、甲基化酶市場主要企業(yè)的市場占有率,同時對甲基化酶行業(yè)的未來發(fā)展做出科學(xué)的預(yù)測。
DNA甲基化:脊椎動物的DNA甲基化一般發(fā)生在CpG位點(胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點,即DNA序列中胞嘧啶后緊連鳥嘌呤的位點)。經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。人類基因中約80%-90%的CpG位點已被甲基化,但是在某些特定區(qū)域,如富含胞嘧啶和鳥嘌呤的CpG島則未被甲基化。這與包含所有廣泛表達(dá)基因在內(nèi)的56%的哺乳動物基因中的啟動子有關(guān)。1%-2%的人類基因組是CpG群,并且CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比。
Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。一些限制酶(PvuⅡ, BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、 Sau3AⅠ)的識別位點中含 GATC 序列,另一些酶 ClaⅠ(1/4)、 XbaⅠ(1/16)、TaqⅠ(1/16)、MboⅠ(1/16)、 HphⅠ(1/16) 的部分識別序列含此序列,如平均 4 個 ClaⅠ 位點(ATCGATN)中就有一個該序列。
有些限制酶對 Dam 甲基化的 DNA 敏感,不能切割相應(yīng)的序列,如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等。對甲基化不敏感的有 BamHⅠ、 Sau3AⅠ、 BglⅡ、 PvuⅠ 等。 MboⅠ 和 Sau3AⅠ 識別和切割位點相同,但其差異就在于前者對甲基化敏感。一般哺乳動物 DNA 不會在腺嘌呤 N6 上甲基化,因此對甲基化敏感的限制酶切割這些 DNA 不會受到影響。當(dāng)需要在這些敏感位點上完全切割 DNA 時,可利用 dam- E.coli 擴增并提取 DNA
目的調(diào)查國內(nèi)6個省市25家醫(yī)院臨床分離鮑曼不動桿菌中介導(dǎo)高水平氨基糖苷類抗生素耐藥的16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB的分布情況。方法收集國內(nèi)6省市8家省級醫(yī)院、浙江省11個地區(qū)17家市級醫(yī)院臨床分離的700株鮑曼不動桿菌。瓊脂稀釋法測定其對妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素、異帕米星、奈替米星5種氨基糖苷類抗生素的最低抑菌濃度(MIC)值;PCR篩選三種甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB,克隆測序明確基因型;脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析菌株的同源性;
質(zhì)粒抽提、接合試驗及Southern雜交確定armA基因定位。結(jié)果對阿米卡星、慶大霉素、異帕米星、奈替米星的耐藥率分別為67.7%、70.9%、75.7%、63.5%和71.5%。對5種氨基糖苷類抗生素全部耐藥的菌株有377株,其中334株檢出armA基因;未發(fā)現(xiàn)rmtA、rmtB陽性菌株。
armA基因陽性菌株P(guān)FGE分型以A、B、C為主。堿裂解法反復(fù)抽提未得到質(zhì)粒,多次接合試驗未成功;Southern雜交顯示,armA基因分別位于克隆A、B、c菌株染色體ApaⅠ酶切PFGE約220、300、220kb大小的PFGE片段上。結(jié)論16SrRNA甲基化酶基因armA在鮑曼不動桿菌中廣泛存在,armA基因位于鮑曼不動桿菌的染色體上。
基因測序應(yīng)用范圍廣,中游測序服務(wù)企業(yè)在技術(shù)集成上將有先發(fā)優(yōu)勢?;驕y序可應(yīng)用于腫瘤檢測、遺傳病檢測等多方面。據(jù)測算,未來基因檢測在腫瘤應(yīng)用領(lǐng)域市場規(guī)模將達(dá)到120億美元,占比60%;婚前、孕前、產(chǎn)前及新生兒基因檢測的市場規(guī)??蛇_(dá)20億美元,占比為10%。
在整個基因測序產(chǎn)業(yè)鏈中,DNA樣本制備儀處于中游的測序服務(wù)提供商將憑借其獨有的技術(shù)獲取先發(fā)優(yōu)勢?,F(xiàn)階段,測序服務(wù)企業(yè)主要有Illumina、Roche、Pacific、Lifetech、華大基因、達(dá)安基因及貝瑞和康等公司,國內(nèi)的醫(yī)院、研究機構(gòu)、藥企等基因測序服務(wù)市場基本被有技術(shù)和成本優(yōu)勢的華大基因、貝瑞和康和安諾優(yōu)達(dá)所占據(jù)。
從行業(yè)專利技術(shù)情況來看,隨著近年來我國基因檢測行業(yè)的不斷發(fā)展,研究的持續(xù)深入,行業(yè)相關(guān)專利數(shù)量也隨之不斷增長。數(shù)據(jù)顯示,2021年我國基因檢測相關(guān)專利數(shù)量為924件,同比下降1.3%。
根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,受疫情影響,我國基因檢測行業(yè)市場規(guī)模增速放緩,達(dá)151億元,同比增長1.3%。預(yù)計到2023年行業(yè)規(guī)模將達(dá)300億元。2020年受疫情影響,我國消費級基因檢測市場規(guī)模有所下滑,為68.5百萬美元,同比下降13.9%。隨著疫情被有效控制,在需求的推動下,預(yù)計2023年行業(yè)規(guī)模將達(dá)158.3百萬美元。
(1) 甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物,如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段,則說明該位點存在甲基化;反之,說明被檢測的位點不存在甲基化。
(2)亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計BSP引物進(jìn)行PCR,在擴增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶,最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測序,可以提高測序成功率,這種方法稱為BSP-克隆測序法。
(3) 高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting,HRM)
在非CpG島位置設(shè)計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物,這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化,用亞硫酸氫鹽處理后,未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變,樣品中的GC含量發(fā)生改變,從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。
中研研究院對甲基化酶市場研究結(jié)論及發(fā)展建議
第一節(jié) 甲基化酶行業(yè)研究結(jié)論及建議
第二節(jié) 中研普華甲基化酶行業(yè)發(fā)展建議
一、甲基化酶行業(yè)發(fā)展策略建議
二、甲基化酶行業(yè)投資方向建議
三、甲基化酶行業(yè)投資方式建議
甲基化酶行業(yè)報告由中研普華行業(yè)分析專家領(lǐng)銜撰寫,主要分析了行業(yè)的市場規(guī)模、發(fā)展現(xiàn)狀與投資前景,同時對甲基化酶行業(yè)的未來發(fā)展做出科學(xué)的趨勢預(yù)測和專業(yè)的行業(yè)數(shù)據(jù)分析,幫助客戶評估甲基化酶行業(yè)投資價值。
甲基化酶行業(yè)報告對我國內(nèi)行業(yè)的供需狀況、發(fā)展現(xiàn)狀、子行業(yè)發(fā)展變化等進(jìn)行了分析,重點分析了國內(nèi)甲基化酶行業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀、如何面對行業(yè)的發(fā)展挑戰(zhàn)、行業(yè)的發(fā)展建議、行業(yè)競爭力,以及甲基化酶行業(yè)的投資分析和趨勢預(yù)測等等。報告還綜合了行業(yè)的整體發(fā)展動態(tài),對行業(yè)在產(chǎn)品方面提供了參考建議和具體解決辦法。
未來甲基化酶行業(yè)現(xiàn)狀如何?想了解更多相關(guān)內(nèi)容,請關(guān)注或查看中研研究院出版的報告:《2023-2028年甲基化酶行業(yè)市場深度分析及發(fā)展策略研究報告》。
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